Neue Ansätze zur Analyse von mikrobiellen Gemeinschaften in Böden: Die Phospholipidfettsäuren-Analyse und ihre Anwendung
Endre Laczko
Solvit E. Laczko. Langsägestrasse 15. CH-6010 Kriens
Veröffentlicht im Bulletin Bodenkundliche Gesellschaft der Schweiz 18: 23-28.
1. PLFA? - Eine kurze Einführung
RESUME (texte français)
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1. PLFA? - Eine kurze Einführung
1.1. Methodische Lücken der Mikrobiologie
Die Bestimmung der Mikroorganismen-Vielfalt in unserer Umwelt (Anzahl und Häufigkeit der anwesenden Spezies = ökologische Vielfalt), sowie die Beschreibung ihrer Gemeinschaftsstruktur (Organisation in ökologischen oder taxonomischen Einheiten) ist mit den klassischen Methoden der (Boden-) Mikrobiologie nicht möglich (zB. Atlas 1983, Torsvik et al. 1990):
- Direkte, mikroskopische Methoden erlauben keine Differenzierung von ökologischen oder taxonomischen Einheiten, da die einfachen morphologischen Merkmale der Mikoorganismen hierzu nicht ausreichen.
- Indirekte, auf der Kultivation beruhende Techniken sind selektiv und erfassen nur einen Teil der Organismen. Man schätzt diesen Anteil auf weniger als 1% der Bodenmikroorganismen.
- Die etablierten indirekten, auf Aktivitäten oder Biomolekülen (Enzyme, ATP, DNA,..) beruhenden Methoden haben ein zu geringes Differenzierungsvermögen oder erlauben keine Zuordnung zu sinnvollen bzw. interpretierbaren Einheiten.
Erschwerend kommt hinzu, dass die bis heute bekannten und beschriebenen Mikroorganismenspezies vermutlich nur den geringsten Teil der tatsächlich Vorhandenen darstellen (zB. O'Donnell et al. 1993). Eine strikt art- oder genombezogene Vielfaltsmessung oder Gemeinschaftsbeschreibung, wie sie etwa bei Tier- oder Pflanzengemeinschaften angewandt wird, ist nicht durchführbar. Für die unbekannten Organismen lassen sich selbstredend keine Kultivationsbedingungen oder genetische Qualitäten formulieren.
1.2. Fragen der Zeit
Die indirekte Beeinflussung und die direkte Umgestaltung der Umwelt durch den Mensch hat vielfältige ökologische Auswirkungen. Einzelne sind offensichtlich oder hinreichend untersucht. Andere, wie etwa die Veränderung der Mikroorganismen - Gemeinschaften werden vermutet, sind aber in ihrer Richtung, in ihrem Ausmass und ihrer Bedeutung für unsere Ökosysteme, zB. auch für unsere Böden, nicht oder ungenügend bekannt (zB. Pimm 1984, Rudaz und Brüning 1990 oder Lubchenco et al. 1991). Aktuelle globale und nationale Forschungsprogramme räumen den Fragen rund um die Biodiversität eine hohe Priorität ein (zB. Lubchenco et al. 1991, Botschaften zum NFP31 und SPPU des Schweizerischen Nationalfonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung). Die Untersuchung der ökologischen Vielfalt der (Boden-) Mikroorganismen und ihrer Bedeutung für die besiedelten Ökosysteme (Boden, Bodenfruchtbarkeit) verlangt nach neuen Methoden und nach neuen Ansätzen.
1.3. Eine neue Methode und neue Forschungs-Ansätze
Mikroorganismenspezies lassen sich hinsichtlich ihrer Lipid- und Lipid-Fettsäure-Zusammensetzung charakterisieren und identifizieren (zB. Suzuki et al. 1993). In der Taxonomie der Bakterien und anderer Mikroorganismen gibt es hierzu etablierte Methoden und Datenbanken. Analog erlaubt die Analyse der Lipide und Lipid-Fettsäuren ganzer Organismengemeinschaften bzw. von Umweltproben ihre Chrakterisierung und Wiedererkennung (zB. Tunlid und White, 1990), ohne die einzelnen Glieder der Gemeinschaft in ihrer taxonomischen Identität erfassen zu müssen.
Für die Analyse der (Boden-) Mikroorganismen-Gemeinschaften eignen sich speziell die Fettsäuren der Phospholipide (PLFA) sehr gut, weil ihre effiziente Extraktion / Isolation aus praktisch allen Umweltproben möglich ist und weil bei der Analyse nur Fettsäuren aus intakten Zellen (cytoplasmatischen Membranen), also aus lebenden Organismen erfasst werden (zB. Zelles et al. 1992). Die Empfindlichkeit der Methode ist für die meisten Fragestellungen vollständig ausreichend. Es können zur Zeit etwa 1-10 nMole einer PLFA je kg trockenen Boden nachgewiesen und quantifiziert werden. Diese Menge entspricht etwa dem Äquivalent von 10'000 bis 100'000 Bakterienzellen, oder einem Anteil von 0.1 bis 0.001 Promille der üblicherweise in einem Gramm Boden vorhandenen Bakterien. Es lässt sich Abschätzen, dass bei dieser Empfindlichkeit auch die PLFA erfasst werden können, die nur in Organismen mit einem Biomasseanteil von 0.1 bis 1% an der mikrobiellen Gesamtbiomasse vorhanden sind.
Die PLFA zeigen die gleiche chemische Vielfalt wie die für taxonomische Zwecke benutzten Struktur- bzw. Zell-Fettsäuren (deren grösste Teil aus Phospholipiden stammt):
- Variierende Kettenlängen (taxonomisch relevant n = 10 - 24)
- Kettenverzweigungen (iso-, anteiso- und cyclo-Derivate, Methylgruppen)
- Doppelbindungen in verschiedener Anzahl und Position (gesättigt, mono- und polyungesättigt)
- Substituenten (Hydroxy-Derivate)
Die PLFA-Synthese ist reguliert und teilweise von Taxon-typischen Enzymsystemen
abhängig, d.h. dass die PLFA-Zusammensetzung eines Organismus durch
physiologische und genetische Faktoren festgelegt ist und dass eine Auswahl
von PLFA als taxonomische Marker dienen kann.
Gestützt auf die begründete Annahme, dass die speziesbezogene Vielfalt
und die chemische PLFA-Vielfalt einer Mikroorganismengemeinschaft
korrespondieren, ist es mit einer PLFA-Analyse möglich die Vielfalt
einer Gemeinschaft zu beschreiben (zB. mittels eines Shannon-Indexes für
die PLFA), eine Gemeinschaft zu charakterisieren und zu identifizieren (mittles
des PLFA-Musters), sowie qualitative und quantitative (taxonbezogene)
Informationen zu ihrer Struktur bzw. Zusammensetzung zu gewinnen.
2.1. Probenahme
Die PLFA-Analyse liefert ein Abbild der PLFA-Zusammensetzung in der untersuchten Probe zum Zeitpunkt unmittelbar vor der Lipid-Extraktion. Um ein "in situ" Abbild zu erhalten, müssen die Phospholipide sofort nach der Probenahme (innert Minuten) extrahiert und möglichst vom Bodenrückstand getrennt werden. Bei Feldarbeiten können die Proben durch suspendieren im Lösungsmittelgemisch für die Lipid-Extraktion sofort nach der Probenahme stabilisiert werden. Die gelösten Lipide lassen sich im Kühlschrank lagern (Monate). Jede andere Lagerung, Vorbehandlung oder Konservierung der Proben führt zu Veränderungen in der PLFA Zusammensetzung (Trocknen, Kühlen, Tiefkühlen, ...zB. White 1983).
2.2. Analyse
Die PLFA-Analyse erfolgt gemäss etablierten Vorschriften. Die in unserem Labor eingeführte, weit entwickelte und für die Analytik von Böden geeignete Variante beschrieben kürzlich Zelles und Bai (1994). Die Analyse gliedert sich in die folgenden Schritte:
- Extraktion der gesamten Lipide
- Isolierung der Phospholipide
- Verseifung der Phospholipide und Isolation der PLFA-methylester
- Auftrennung der PLFA-methylester in bis zu 6 Fraktionen
- Derivatisierung der ungesättigten PLFA-methylester und der Hydroxy-PLFA-methylester
- GC-MS-Analyse ausgewählter Fraktionen im SCAN-Modus
2.3. Auswertung der GC-MS-Chromatogramme
Die sehr umfangreichen und in digitaler Form gespeicherten GC-MS-Chromatogramme werden mit Hilfe eines speziellen Programmes ausgewertet. Dieses Programm wurde in enger Zusammenarbeit mit den Autoren der obgenannten Publikation (Zelles und Bai 1994) von der Gesellschaft für Strahlenforschung gsf in München entwickelt und wird in andauernder Kooperation erweitert und gepflegt. Das Auswertungsprogramm leistet folgende Arbeiten:
- Alle MS-Spektren der digitalen GC-MS-Chromatogramme werden mit MS-Spektren einer digitalen Fettsäure-Bibliothek, die zur Zeit rund 360 Einträge enthält, verglichen.
- Die gegen einen Zeitstandard justierten, relativen Retentionszeiten (= CRRT) der jeweils 20 besten MS-Identifikationsvorschläge werden mit den CRRT der Fettsäurebibliothek verglichen. Die Fettsäure mit der besten CRRT-Übereinstimmung wird als Identifikation akzeptiert, sofern die Abweichung weniger als 0.003 Minuten beträgt.
- Mit Hilfe eines internen Standards (n19:0, Einpunkteichung) und experimentell ermittelten bzw. abgeleiteten Responsfaktoren werden alle identifizierten Fettsäuren quantifiziert.
Die Ergebnisse der Auswertung werden in einer Liste dargestellt. Die Daten der identifizierten Fettsäuren werden zusätzlich in eine Datenbank übertragen.
2.4. Interpretation
Die Resultate der Chromatogramm-Auswertung, Listen von Fettsäuren und ihren Gehalten im Boden, können auf grundsätzlich zwei verschieden Arten weiter ausgewertet und interpretiert werden. Bei der ersten Variante werden nur die PLFA-Muster, ohne einen taxonomischen Bezug zu schaffen, betrachtet:
- Berechnung eines PLFA-Diversitätsindex. Dieser Index steht für die globale Diversität oder Komplexität der Organismengemeinschaft (bzw. PLFA-Diversität einer Probe, eines Musters).
- Mittels statistischer Methoden lassen sich die PLFA-Muster (Zusammensetzungen) verschiedener Proben miteinander und / oder mit Umweltfaktoren vergleichen. Denkbar sind Korrelationsanalysen (zur Prüfung der Abweichung von einem Soll, einer Kontrolle), Ähnlichkeitsanalysen (Dendrogramme zur Klassierung von PLFA-Mustern) oder Faktorenanalysen (Klassierung, Vergleiche mit Einbezug von zB. Umweltfaktoren)
Bei der zweiten Variante werden die PLFA-Listen nach Marker-Fettsäuren, die für bestimmte taxonomische Einheiten stehen, herausgesucht, um Anhand dieser PLFA die qualitative Zusammensetzung der Gemeinschaft und die relativen Anteile der erkannten Glieder zu beschreiben. Eine Liste solcher Marker geben zB. Tunlid und White (1990).
2.5. Methodische Mängel und Grenzen
Es ist bekannt, dass die Wachstumsbedingungen bzw. die Lebensbedingungen der Mikroorganismen ihre PLFA-Muster beinflussen. In Laborexperimenten konnten variierende PLFA-Zusammensetzungen von Bakterien-Reinkulturen zB. als Funktion der P-Limitation, der Temperatur, des Substratangebotes und des Zell-Alters, nachgewiesen werden (zB. Suzuki et al. 1993). Die Bedeutung dieser Laborbefunde für die PLFA-Zusammensetzung von Bodenproben ist aber nicht bekannt. Der Schluss, dass die PLFA-Muster für eine reproduzierbare und interpretierbare Umweltproben-Analyse nicht taugen ist falsch. Die bestehenden Erfahrungen zeigen das Gegenteil (siehe zB. Zelles und Bai 1994 und die darin zitierte Literatur und Suzuki et al. 1993). Sicherlich ist die Auswertung der Marker-Fettsäuren mit Unsicherheiten verbunden. Marker können infolge wechselnder Umweltbedingungen fehlen. Es kann aber auch zutreffen, dass die Bedingungen in einem Boden mikrobielle Gemeinschaften, bzw. ihren pysiologischen Zustand stabilisieren, bzw. Schwankungen genügend stark dämpfen. Diese Fragen bedürfen einer Abklärung und sind Gegenstand von aktuellen Arbeiten, auch in unserem Labor. Festzuhalten ist auch, dass nur vereinzelt ein quantitativer Zusammenhang zwischen Marker-PLFA und der Biomasse der angezeigten Organismen etabliert ist. Es ist aber anzunehmen, dass die notwendigen Grunddaten für immer mehr Marker-PLFA nach und nach erarbeitet werden.
In unserem Labor konnte in einer Einzeluntersuchung von 9 Böden eine Korrelation zwischen der PLFA-Diversität und der Reaktion der Bodenmikroorganismen auf Vitamingaben nachgewiesen werden (Korner und Laczko 1992). Es zeigte sich, dass Böden mit geringer PLFA-Diversität ihre Basalatmung nach Vitaminzugabe wesentlich steigerten, also in diesem Sinne vitaminbedürftig waren. Böden mit hoher PLFA-Diversität zeigten keine Reaktion.
In einem anderen exemplarischen Experiment wurde einem Boden p-Terphenyl, zur Simulation einer Bodenverunreinigung durch einen mikrobiell langsam abbaubaren organischen Schadstoff, zugesetzt. Gegenüber einer unbehandelten Kontrolle wurden irreversible und massive Veränderungen im PLFA-Muster des odens festgestellt. Die Interpretation der vorhandenen Marker-PLFA führten zB. zu den Aussagen, dass vorallem Gram-positive Bakterien am Abbau des p-Terphenyl beteiligt waren und dass sich anaerobe Nischen ausbildeten (unveröffentlichte Daten).
Im Rahmen unserer aktuellen Projekte untersuchen wir die Sukzession der Bodenmikroorganismen beim Verbrachungsprozess (Analogsimulation der Einwirkung der Klimaänderung, NFP31 / Projekt 4031 - 033151), die mikrobielle Diversität unserer Böden und die Stabilität von anthropogen beeinflussten bzw. gestörten mikrobiellen Gemeinschaften in Böden (SPPU Mod. 3 / Projekt 5001 - 34859).
Für die Beurteilung der zunehmenden direkten und indirekten menschlichen Einwirkungen auf unsere Böden sind vertiefte okölogische Kenntnisse über die Bodenmikroorganismen notwendig. Die Analyse der Phospholipidfettsäuren (PLFA) in Bodenproben bietet hierzu neue Ansätze. PLFA sind Bestandteil der Zellmembranen aller lebenden Organismen und lassen sich durch einfache Extraktions- und Chromatographieprozeduren isolieren und mittels GC-MS identifizieren und quantifizieren.
Die bestehenden Erfahrungen zeigen, dass die PLFA-Analyse Einblicke in die Komplexität und in die Struktur von (in situ) Mikroorganismen-Gemeinschaften ermöglicht. Die PLFA - Analyse ist automatisierbar, was den Vergleich vieler Proben (Böden) erlaubt. Damit kann sie einen substantiellen Beitrag zur Biodiversitäts-Forschung, bei grundlagen- wie auch bei anwendungsorientierten Projekten leisten.
Pour l'évaluation des influences anthropogènees sur les sols une co-naissance plus profonde de l'écologie des microorganismes est nécessaire. L'analyse des acides gras des phospholipids (PLFA) du sol offre des possibilités nouvelles pour approcher cette connaissance des besoins actuelle de la recherche écologique. Les PLFA sont des constituants de la membrane cellulaire des tous les organismes vivants. Leurs extraction et isolation du sol sont relativement faciles suivant des procédures bien établies. Leurs identification et quantification sont possibles par GC-MS.
L' expérience actuel démontre que l'analyse des PLFA fait possible l'observation de la complexité des communautés microbiennes et donne des information sur la structure taxonomique des communautés microbiennes. Lorsque l'analyse est automatisable une grande nombre des échantillons peuvent être comparer. En conclusion, l'analyse des PLFA donne des résultats qui doit être des contribution importantes pour la recherche de la biodiversité microbienne.
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